Cinéma moléculaire ultra-rapide : voir les protéines absorber la lumière

Utilisant un procédé inédit, un chercheur de l'Institut de physique de Rennes a contribué à filmer les processus ultra-rapides à l'œuvre dans les protéines fluorescentes, largement utilisées comme marqueurs en imagerie du vivant. Ce nouveau procédé, qui utilise des lasers gigantesques aux rayons X, permet d’étudier les processus tels que la vision, la bioluminescence et d'autres jusqu'ici inobservables. Publication dans Nature Chemistry le 11 septembre 2017 par une collaboration internationale (CEA, CNRS, Universités Grenoble-Alpes, Lille, Rennes 1, Paris-Sud et Institut Max-Planck de Heidelberg en Allemagne).

Cinéma moléculaire ultra-rapide : voir les protéines absorber la lumière
  1. Une explosion pour chaque image
  2. Résultat
  3. Référence

La microscopie optique super-résolution, ou « nanoscopie », a révolutionné l’imagerie du vivant, grâce au marquage des molécules à imager avec des protéines fluorescentes dites « photo-commutables ». Ces minuscules interrupteurs moléculaires passent réversiblement d’un état fluorescent (on) à un état éteint (off) après excitation par un flash lumineux (on parle de photo-commutation). Pour les concevoir sur mesure, il est nécessaire de comprendre leurs mécanismes de photo-commutation, qui impliquent des états transitoires ultra-rapides.

Pour la première fois, les scientifiques ont pu filmer la commutation en temps réel d'une protéine fluorescente en utilisant une toute nouvelle génération de source de rayons X, les lasers à électrons libres (XFEL, pour X-ray free electron laser). Ces dispositifs produisent des impulsions de rayons X très courtes de l’ordre de la femtoseconde (un millionième de milliardième de seconde) et très intenses au cœur d'une installation longue de plusieurs kilomètres.

Une explosion pour chaque image

Au centre de l'accélérateur linéaire de Stanford (SLAC Linear Accelerator Center), les auteurs de l’étude ont fait coïncider un flux de minuscules cristaux de la protéine fluorescente avec les impulsions de rayons X, collectant ainsi une myriade de clichés de diffraction. Étant donné l’extrême intensité du faisceau de rayons X, chaque cristal impacté explose immédiatement après que l’information de diffraction a été collectée – d’où la nécessité de constamment renouveler l’échantillon dans cette technique dite de « cristallographie sérielle ». Pour observer des états intermédiaires entre les deux états statiques on et off, la réaction photochimique est provoquée dans la protéine par un flash laser lumineux déclenché à peine une picoseconde (un millième de milliardième de seconde) avant l’impact d’une impulsion de rayons X.

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Rendu animé interprétant les clichés de diffraction obtenus : après excitation, le chromophore au coœur de la protéine passe d'une configuration stable à l'autre en une picoseconde. Sa vitesse de déplacement (460 picomètres/seconde) correspond, toutes proportions gardées, à celle d'un avion supersonique (460 m/s). Animation réalisée d'après Coquelle N. et al.

 

Résultat

C’est ainsi que les auteurs (au nombre desquels Marco Cammarata, chargé de recherche CNRS à l'Institut de physique de Rennes) ont pu déterminer la structure transitoire de la protéine fluorescente dans son état excité, et observer  le chromophore – la partie de la protéine qui absorbe la lumière – dans un état tordu (« twisté »), à mi-chemin entre les conformations stables des états on et off (cf. figure). Cette observation, confirmée par des simulations, a permis aux chercheurs d’émettre des hypothèses sur le mécanisme de photo-commutation de la protéine. Ces hypothèses ont ensuite pu être vérifiées grâce à la mutagénèse dirigée.

 

Seuls deux lasers X à électrons libres sont actuellement opérationnels au monde : celui qui a été utilisé pour cette étude à Stanford, dans la Silicon Valley aux Etats-Unis (instrument LCLS du SLAC National Accelerator Laboratory), et l’autre au Japon, dans la province d’Osaka (SACLA). Le premier laser à électrons libres européen, auquel la France a contribué, sera mis en service fin 2017 à Hambourg (Allemagne). L’une des premières expériences prévues sur ce nouvel instrument, qui permettra de passer de 100 images / seconde au maximum à près de 3 000, sera menée par le consortium auteur de cette étude. De quoi promettre un avenir radieux au cinéma moléculaire !

Référence

Chromophore twisting in the excited state of a fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography
Coquelle N.  et. al., Nature Chemistry, septembre 2017