Nouvelle méthode de microscopie pour la localisation fine des protéines

Au sein de tissus et d'organes isolés, la méthode de microscopie corrélative développée à Rennes (UMS Biosit/plateforme Mric) relève de l'Array Tomography. Elle associe la photonique, et la microscopie électronique à balayage. Elle est particulièrement optimisée pour préserver la fluorescence, et elle innove en permettant l'analyse de larges surfaces de manière non destructive. Publication dans la revue Development.

Microscopie corrélative 3D sur 8 coupes consécutives du ver C. elegans - Crédit : Mric/Biosit/UR1
  1. Additionner les qualités de deux techniques d'imagerie
  2. Une technique particulièrement innovante
  3. Le protocole en bref
  4. Référence

Les questions de biologie cellulaire et du développement exigent de connaître la localisation de cellules ou d’organites particuliers au sein de tissus biologiques multiples et variés, par exemple lors de l’étude différentielle entre un organisme modèle mutant et un organisme sauvage.

Une nouvelle méthode de microscopie corrélative aidant à la localisation fine des protéines au sein de tissus ou d’organes isolés vient d'être développée à Rennes, sur la plateforme Mric de l'UMS Biosit dirigée par Thierry Guillaudeux. Ce travail s’est construit grâce à une collaboration avec le Dr. Irina Kolotueva de l’Université de Lausanne.

L'équipe de la plateforme Mric/Biosit - De g. à dr. et de b. en h. : Frédéric Mourcin, Grégoire Michaux, Marc Tramier (dir.), Stéphanie Dutertre, Sébastien Huet, Agnès Burel, Xavier Pinson, Denis Chrétien, Aurélien Dupont.
A. Burel et S .Dutertre ont participé plus spécifiquement à ce projet d'Array Tomography.

Additionner les qualités de deux techniques d'imagerie

L’imagerie cellulaire constitue un outil indispensable pour comprendre les processus biologiques et la microscopie photonique est un outil incontournable pour répondre à des questions relatives à la localisation, l’activité dynamique et les interactions des protéines. Et cela, que ce soit dans différents organes ou bien au sein de structures cellulaires.

La microscopie électronique en transmission (TEM) apporte quant à elle des informations ultrastructurales précises à l’échelle nanométrique.

Pour améliorer la transition entre la microscopie photonique et la microscopie électronique ou pour combiner les deux, plusieurs nouveaux protocoles appelés CLEM (ou "microscopie corrélative lumière-électron") ont été développés ces dernières années afin de d’améliorer l’étude de l’expression de protéines fluorescentes, couplée à l'obtention d'une résolution ultra structurale.
 

Une technique particulièrement innovante

L’AT SEM développée sur la plateforme Mric de Biosit est une technique alternative à l’utilisation des coupes sériées en TEM ainsi qu’à l’imagerie SBF (Serial Block Face) SEM car elle permet l’analyse de larges surfaces de façon non destructive. Elle donne une corrélation directe des échantillons entre les informations fournies en  microscopie photonique et en électronique. Les échantillons sont transférés sur un support solide qui peut être ré-imagé de multiples fois et même re-contrasté.

Le développement mis au point sur la plateforme Mric de Biosit est donc un protocole en imagerie électronique conçu pour l’Array Tomography volumétrique, particulièrement optimisé pour préserver la fluorescence. Les coupes sériées sont :

  1. transférées sur une lame ou sur une galette de silicium,
  2. rapidement criblées par microscopie photonique ou électronique afin d’examiner initialement l’anatomie globale de l’échantillon
  3. puis plus précisément pour étudier les cellules ou les organes d’intérêt.

Le protocole en bref

La technique d’Array Tomography (AT) a été développée initialement pour localiser certaines protéines présentes dans les synapses.

Pratiquement, les échantillons sont enrobés dans une résine hydrophile et coupés à l’ultramicrotome en de longs rubans de coupes sériées, qui sont ensuite transférés sur lame de verre. À la suite de cette préparation, plusieurs stratégies d’imageries sont possibles :

  • la microscopie photonique en multiplex pour détecter plusieurs fluorophores,
  • l’analyse TEM des coupes sériées pour reconstituer un volume d’acquisition et reconnaitre une région d’intérêt et assurer une préservation de l’ultrastructure cellulaire,
  • la Microscopie corrélée entre photonique et électronique, basée sur la préservation de la fluorescence (en bloc de résine et en section) ainsi que sur une qualité d’ultrastructure correcte en microscopie électronique à balayage (scanning electron microscopy ou SEM).

La méthode rennaise d'AT-SEM permet une localisation efficace et facilitée de structures (cellules, organites particuliers) au sein de tissus biologiques multiples et variés, notamment sur des échantillons asymétriques et des organismes modèles (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Danio rerio).

Référence

A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography

Agnès Burel, Marie-Thérèse Lavault, Clément Chevalier, Helmut Gnaegi, Sylvain Prigent, Antonio Mucciolo, Stéphanie Dutertre, Bruno M. Humbel, Thierry Guillaudeux, Irina Kolotuev
Development 2018 145: dev160879 doi: 10.1242/dev.160879 Published 21 June 2018